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  （1）将2ml含相应抗生素的LB液体培育基参加到通气杰出的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振动培育过夜。

  （2）将1.5ml培育物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4℃以12000g离心5min，将剩下的培育物储存于4℃。

  （1）将细菌沉积[上述过程（3）所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA）中，剧烈振动。

  （2）加200μl新制造的溶液Ⅱ（0.2mol/l NaOH, 1%SDS），平缓振动，水浴5min。

  （3）加150μl预冷溶液Ⅲ（50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml），平缓振动，冰浴5min。

  （6）用2倍体积无水乙醇室温沉积双链DNA，振动混合，于室温放置2min。

  （8）当心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。

  （9）用75%乙醇于4℃洗刷DNA，同上离心去上清线μg/ml无DNA酶的胰RNA酶），振动，储存于-20℃。

  （2）将1ml含菌液倒入含相应抗生素的Lb 100ml中，37℃振动培育至A590=1.0(5～6h)。

  （4）搜集菌液于离心管中，冰浴10min。3000rpm,离心10min，去上清。

  （5）加溶液Ⅰ5ml悬浮菌体，将悬液倒入高速离心管中，摇匀，冰浴5min。

  （7）加溶液Ⅲ7.5ml悄悄混匀，冰浴30min。15000rpm，4℃离心20min。

  （8）取上清液于高速离心管中，加2倍体积的无水乙醇，混匀，入-20℃3～5h。

  （10）弃上清，将离心管倒放入线×TE溶解，参加RNase A 15～20μl，42℃水浴4h于过夜。

  （12）参加5ml饱满酚，混匀，4000～5000rpm离心5min，取上清液入5ml离心管内。

  （13）别离参加2.5ml饱满酚，2.5ml氯仿，混匀后相同离心搜集上清。

  （15）参加1/10体积的3mol/l NaAc及2倍体积的无水乙醇于-20℃3～5h。

  （1）在0.5ml Eppendorf管中加剧蒸水6μl，10×Buffer 1μl，DNA 2μl，酶1μl，混匀，37℃水浴1h以上。

  同质粒DNA的判定，仅仅是质粒DNA换为载体DNA。若很多酶切，则成份额添加。

  （2）加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀，-20℃2h以上。

  （4）参加75%乙醇洗刷2次，离心弃上清，线×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。

  （7）参加线倍于载体的待刺进DNA片段，衔接缓冲液及T4衔接酶适量至整体积为20μl，在12～14℃反响12～16h。

  （2）取0.25ml过夜菌入25ml LB培育液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。

  （3）倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。

  （4）缓慢参加75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。

  （5）缓慢参加75mmol/L预冷CaCl21.0ml悄悄混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。

  （1）将3只Eppendorf管按下列转化项目作好符号，然后按下述进行：

  （5）参加无相应抗生素的Lb 200μl，混匀后，37℃水浴30～60min。

  （6）别离取3组反响物各50μl在含相应抗生素的固体LB培育基平皿上涂布，室温下枯燥，然后倒置于37℃温箱中培育过夜。

  （1）挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中，37℃振动培育至A590值为0.6～0.8。

  （2）取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm离心9min，去尽上清。

  （3）参加70μl Cracking Gel缓冲液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,20%SDS 10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚蓝1.67ml，加双蒸水至200ml]，混匀后，37℃水浴30min以上。

  （2）菌液移至5ml Eppendorf 管中，9000rpm,离心9min，去上清。

  （3）加溶液Ⅰ100μl，溶液Ⅱ200μl，溶液Ⅲ150μl，混匀，冰浴10min。

  （6）15000rpm离心15min，弃上清，参加75%乙醇洗刷2次。

  2．转化子DNA的小量酶切判定同质粒DNA的小量酶切判定，见本节一（三）。

  （2）于紫外灯下从凝胶上切下所要的DNA带，装入含1×TBE缓冲液的透析代内，用夹子封好袋口，并查看有没有漏孔。

  （3）将透析袋（纵长）与南北极间的边线笔直放于电泳槽内电泳，4～5V/cm电泳至DNA贴紧袋壁。

  （4）取出透析袋，挤出凝胶块，吸出袋内液体放入1.5ml的离心管内，10000rpm离心5min。

  （5）吸出上清放入离心管内，参加等体积的饱满酚和等体积的氯仿，振动混匀，10000rpm离心5min，吸出上清放入新的离心管内。

  （6）参加1/10体积的3mol/L AaAc,2倍体积预冷的无水乙醇，于-20℃放置4～5h。

  （8）用75%的酒精洗刷2次，每次均于4℃，10000rpm离心5min，弃上清。